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第十八章　 斑馬魚與牛蛙實驗動物

一、斑馬魚

近年來斑馬魚(Zebrafish, Danio rerio)已發展為一研究脊椎動物胚胎發育的重要模式動物，其優點包括：具有光週期誘發產卵、體外受精、胚胎透明、胚胎發育期短（2-3天）、器官形成的過程易於觀察、性成熟期短（3個月）、可以物理及化學方法產生變種魚、可用分子生物學方法改變特定基因的表現及產生基因轉殖魚等特性。且最近對一些變種的研究已顯示在一些器官組織如耳朵、肌肉、心臟、眼睛、血液、脊柱、胰臟及腎等所產生的缺陷，與人類這些器官所產生的一些疾病之病理特徵相似，且為相同基因變異所造成，因此，斑馬魚可進一步做為人類疾病研究的動物模式。同時，許多結果顯示，近兩年來用斑馬魚來探討藥物作用的機制，如一些心血管、抗血管形成及抗癌症等藥物，都已經發現在斑馬魚胚胎及哺乳類系統皆能產生相似的生理及形態的反應。另外，以一些小分子的化學物質浸泡處理斑馬魚胚胎，亦可觀察到明顯的器官及發育上的變化，且有些化學物質所引起器官的改變與特定基因缺陷所產生的變種相類似。因此斑馬魚可用來從事下列藥物研究，例如化學藥物庫的篩選、藥物毒性及畸型的預測、藥理及毒物基因學等研究。同時，更可以斑馬魚做為測試人類治療新藥的一個介於細胞培養及昂貴的老鼠活體測試系統的橋樑。
中央研究院動物所1996年自美國州立奧立岡大學引進斑馬魚，加以繁殖，並供應國內大學及研究單位斑馬魚種魚，以自行繁殖。隨著斑馬魚優點逐漸受到研究學者肯定，以斑馬魚做為模式動物的研究將會逐年增多 。

(一)
生活史

斑馬魚原產於東印度，為廣溫性魚類，與金魚、鯉魚一樣屬於鯉科。成熟斑馬魚體長只有3-4公分，最大約5公分，體紋與真正的斑馬相似，有藍白相間的條紋，但與斑馬不同的是，斑馬魚的條紋是水平的。在適當的環境下，斑馬魚在攝氏24°C以上極易產卵，同時產卵無季節性，可利用人為調控光週期使雌魚產卵，每次可達數百顆。此次至下次產卵只需3-6天。在28.5°C，受精卵2-3天即可孵化，3個月就能達到性成熟。斑馬魚易於取得且操作方便，因此其魚卵常被生物學家做為胚胎實驗的對象，在基因轉殖實驗上的優點包括：魚卵及卵膜透明、卵黃囊位於中央易於辨識、生長期短等 。
(二)
飼養管理

1.
飼料
餵食較多樣性的食物可使斑馬魚維持在一個較健康的繁殖情況。孵化後5-7天的幼魚可以草屢蟲當初期的餌料，2週後餵食小豐年蝦，約1.5個月後，即可以豐年蝦製成的人工飼料餵食。
幼魚以草屢蟲當初期的餌料，在自來水中加入少許的水溝水（含有草屢蟲），並加入些許的酵母粉，靜置於室內（切勿打氣），可以提供草屢蟲生長的環境。成魚每天至少早、晚餵食人工飼料，如可能則可少量多餐，以餵食的飼料能在5分鐘內吃完為標準，每一缸餵食的量要足夠，確保每一隻魚都有吃到。產卵的前一天，種魚可餵食3餐，以供給足夠營養，產的卵會較好 。
2.
飼養空間與環境
每缸45公升的魚箱可以容納25條成魚，一般以玻璃為材質的水族箱是最常見到的飼育容器。又因水量需求不同，而有玻璃厚度與強化與否的差異，常見小型的水族箱厚度多在3~5mm，大型水族箱厚度約為5~12mm。大型魚缸則因水量、水壓的考量，應以強化玻璃較為安全。壓克力魚缸具有材質輕、安全及較佳的彈性等優點，但壓克力本身容易產生霧化，及清洗時容易刮傷 。
3.
水質
成魚可以飼養在自來水中，自來水要先打氣2-3天以排除水中的氯氣，並使用水循環系統的濾水裝置，小型魚缸適用沉水馬達加上海棉組成的水中過濾器，促成水族箱的水適當交流來淨化水質。水溫宜保持在28.5°C (25-31°C之間)，不好的水質會危害魚兒的健康，導致魚兒容易生病，使得生產力降低，如果使用去離子水或蒸餾水，則需要再額外添加鹽類及礦物質 。
4.
清潔與衛生
養殖的過程中，因水質中殘留的食物、生物新陳代謝、個體死亡…等因素，都會造成水質的惡化。故定期更換部份缸水，除了可常保水質潔淨清新外，對於斑馬魚成長與健康更有促進的功能。每週至少以虹吸管清理水缸底部1次，且至少更換1/2-1/3的水。大規模的清理工作，重點集中於濾材的更換、底部的清洗與缸面的清潔工作。
(三)
健康監控與防治

水質惡化，水溫急變，給餌太多，移入斑馬魚的感染，換水時動作過於粗暴，密度過高及水族箱位置不當等，都可能是魚兒帶來疾病的成因。防止疾病蔓延最好的方法就是減少不同缸中的魚水接觸，盡量避免將不同缸內的魚混在一起，無論如何，及早發現，及早治療，才是最佳的根治之道。
發現魚兒食慾減少、游泳姿勢不正常或無法平衡、體色漸退…等，都是魚兒生病的徵兆。外部的疾病，通常發生在皮膚的表面，特別是魚鰭及鰓部，一般比較容易發現。內部的疾病，病原體會定居在魚體內，進而攻擊器官及血管，較難發現；
斑馬魚最常見的疾病為velvet disease 和fish tuberculosis (mycobacteriosis)。velvet disease為一寄生蟲附著在魚鰭（尤其是背鰭）或鰓周圍，常見的症狀：雌魚停止產卵、魚兒倦怠、病魚動作遲緩往往於魚缸邊緣遲鈍地游動。魚的 tuberculosis結核病或 mycobacteriosis都是常見的疾病，魚兒可能是吃到不乾淨的食物或因皮膚磨損而受到感染，常見的症狀：魚缺乏食慾、逐漸消瘦、背脊彎曲或呈拱形、體色改變、表皮發炎，內臟長出小結癤，病魚動作遲緩，游泳不正常等 。
(四)
繁殖與培育

1.
斑馬魚的性別區分
雌斑馬魚和雄魚的區別在於：雄魚體型較小、腹部較平坦，在燈光下呈現淡黃色，而雌魚體型通常較大、腹部較鼓脹，體色偏藍色。且當雌魚達性成熟時，腹部開始膨脹。但有些魚因環境或營養的關係，雌雄差異不明顯 。
2.
配種的環境
每 人工繁殖斑馬魚時，要選擇體型較大、活潑好動、雌魚腹部飽滿、達到成熟年齡的種魚。通常斑馬魚在適當的環境下，可每天產卵，當久未產卵後的第1次產卵，斑馬魚通常產出品質較不好的卵，因此繁殖時機為距上次產卵1週後較佳。最好是製造一個適當的環境（主要是光照及水溫並提供營養充足的食物），利用人為調控光週期（日夜循環自動時間裝置14小時白晝，10小時黑夜），使種魚在種魚池內自然成熟交配產卵受精 。
3.
產卵、授精與孵化
產卵開始時必須先將產卵槽洗淨注水打氣2-3天，在產卵的前一天傍晚，按照雌雄的比例1：3將成熟的種魚移到產卵槽以熟悉環境，雌雄以隔版隔開，並用黑布遮蓋產卵槽，避免魚兒受到驚嚇。（光週期黑夜23：30 - 9：30）隔天早晨將黑布打開並抽離隔版，產卵槽中魚兒會急速追逐旋游，身體碰觸時同時排出精卵。產卵的活動可以一直延續到中午，但產卵多在產卵開始30分鐘內最多。
鯉科的魚有個特性，大都喜歡吃自己的卵與小魚，斑馬魚的卵是沉性卵不帶粘性，雌雄種魚產卵後會吃掉自己的魚卵，所以須在產卵槽中用產卵網，並且水面不可高於網面太高，好讓產下的卵能夠迅速的沉下網底跟親魚分開，這樣魚卵才不會被吃掉。產卵後一定要把親魚移到別的池子，將受精卵收集後，於孵化池（育苗池）孵化 。
4.
魚苗之培育
胚胎上有小小的白點是死亡的胚胎。健康的胚胎2-3天即可孵化，孵化後3天內因有卵黃囊提供營養，故不需餵食。魚苗孵化3-4天後，消化系統已經發育完成，稚魚會開始游動吃食。目前普遍使用草履蟲當初期餌料，2週後，餵食小豐年蝦，再大一點後就可改以人工飼料餵食。
(五)
麻醉與安樂死

1.
麻醉
麻醉藥劑Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester 又稱ethyl m-aminoboenzoate)配方為400 mg tricaine 粉末溶在97.9 ml 二次水中，再加入2.1 ml 1 M Tris (pH 9)，最後校正至pH 7，儲存在冰箱內備用。當麻醉時，則加4.2 ml tricaine solution至100 ml的水，麻醉時間3-5分鐘 。
2.
安樂死
依上述麻醉方法，以tricaine過量或過度麻醉，以達到安樂死的目的 。



二、牛蛙
兩棲類(蛙及蟾蜍)在早年被用作內泌素(hormone)之生物活性測定(bioassay)或作為懷孕診斷(pregnancy diagnosis)之檢測動物。例如被用作為人類絨毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin; HCG)活性測定，因為HCG可促進蛙或蟾蜍之排卵(ovulation)。也曾被廣泛作為人類懷孕診斷檢測動物。蝌蚪(tadpole)亦被作為腦垂體促甲狀腺激素(Thyroid-stimulating hormone)生物活性測定。而近年來南非有爪蟾蜍(Xenopus laevis)在基因轉錄(gene transcription)及轉譯(translation)之研究，扮演重要角色。從牛蛙(Rana casteibeina)卵純化具有細胞毒性之核糖核酸?(RNAse)，在癌症細胞治療之研究上，亦開始被重視。
在國外之蛙類研究上，常以Xenopus laevis，俗稱南非有爪蟾蜍(South African clawed toad) 為研究材料，由於其繁殖期較無季節性，卵之成熟不具同步性，任何季節均可以孕馬血清促性腺激素( PMSG) 促進卵的成熟，以人類絨毛膜促性腺激素( HCG) 促進排卵，供胚胎發育上之研究。由於該蛙之生活史全在水裡，成蛙只須短暫浮出水面吸氣即可，所以飼養上極為方便，只要一般水缸即可飼養。在台灣若為研究用途，仍可自南非或美國進口Xenopus laevis使用，但其價錢昂貴，進口相關程序繁多。若為一般教學示範使用，先前大都以虎皮蛙 (Rana tigerina rugulosa) 為主要材料，但其生性害羞，食性不同，冬天又有冬眠現象，實驗室養殖不易，牛蛙(Rana casteibeina)容易養殖，應為較好的蛙類研究材料 。
(一)
生活史
牛蛙 (Rana catesbeiana)，原產北美洲，雄蛙叫聲像水牛，俗稱美國牛蛙，成蛙體型巨大，約 500 ~ 700 公克，皮膚顏色黃綠色，但常隨環境及溫度變化而改變呈墨綠色。雄蛙體型較大，下顎有明顯皺摺，耳膜較大，生殖季節有黃色斑紋。雌蛙體型略小，其耳膜亦較小，下顎皮膚平滑，白底具黑點。牛蛙蝌蚪體型亦較其他青蛙之蝌蚪為大，體長約 10 至 15 公分 。
(二)
養殖
牛蛙雖原產北美洲，現已成功的在台灣大量養殖，成為主要的食用蛙，所以在一般較具規模的傳統市場或大賣場上均可買到；若欲購買蝌蚪或特定成熟度的成蛙，可向養殖場洽購，而大部份養殖場均位於南部，尤其高屏地區。南部地區天氣炎熱，成長速度較快且繁殖季節較長，約在每年 2 月至 7 月，適合牛蛙之養殖。
一般實驗室飼養牛蛙，室溫在 20°C ~ 30°C 間，首先需將成蛙置於水深 3 至 6 公分的水缸中後，使其頭部露出水面，持續供應經曝曬過或除氯後之自來水，污水亦須持續自缸底排出，以維持水質乾淨。一般青蛙均屬肉食性，捕捉會動的小“動”物，所以可利用此特性，將浮水性飼料灑在水面上即可飼食牛蛙之成蛙。至於其蝌蚪可飼以沉水性之飼料或經冷凍處理過之葉菜類至變態為止。
若欲觀察胚胎發育及青蛙變態過程，可於生殖季節內（2 – 7 月）於實驗室內進行人工授精。首先購得性成熟公蛙、母蛙（最好為變態後隔年之成蛙）及數個母蛙蛙頭（2 – 6 個）。自頭顱內取下腦下腺（粉紅色）數顆，視原母蛙之成熟度而定，加入少許乾淨的水，以針筒反覆吸放攪碎，再注入母蛙之腹腔內，約 1 – 2 天即可觀察到母蛙膚色變為黃綠，膚質變軟，若有少許排卵即可開始進行人工授精。
將雄蛙麻醉或冰眠後，自腹腔取其睪丸，以剪刀或藥勺攪碎，置於顯微鏡下觀察精子活動情形，若精子活動力旺盛，即可以 5 – 10 ml 之池水稀釋，再平鋪於磁盤或磁碗上。此時即可將蛙卵擠出覆蓋在精液上，輕輕攪拌均勻，約 10 – 15 分鐘後，再將此授精卵稀釋在水深 2 – 3 公分的小盤子內，避免蛙卵擠成一團，影響蛙胚之呼吸，半小時內即可以蛙卵之動物性極（黑色）是否朝上來判斷是否授精。若是，即可觀察授精後之細胞分裂、胚胎發育及變態過程。當蝌蚪進行變態時，由於鰓漸退化改為肺呼吸，故須放置浮板或淺水斜坡供其攀爬，否則變態中之蝌蚪或小蛙會因過度游泳體力不支而淹死；此時須改餵以浮水性食物 。
(三)
健康管理
牛蛙在台灣已可成功的大量養殖，若能有效控制養殖密度、水質及溫度，應可避免很多疾病。一般實驗室須有效控制上述三項因子，若不幸染上疾病，應立即移開受感染牛蛙，必要時需全部撲殺，消毒水缸，重新購買健康之牛蛙。為確保牛蛙之良好健康情況，儘量向有信譽之牛蛙養殖場購買。由於牛蛙屬肉食性，易攻擊任何較小之動物，所以不同體型大小之牛蛙不可飼養在同一缸內，否則小蛙會被大蛙吞食 。
(四)
麻醉
青蛙之麻醉可將青蛙浸泡在 0.1% ethyl m-aminobenzoate (Tricaine, MS222) 約 15 – 30 分鐘，即可使其麻醉。若將青蛙以碎冰覆蓋約 30 分鐘，類似冬眠現象亦可使其失去知覺，以降低因手術而造成之痛苦 。
註：本章斑馬魚實驗動物部份由廖欽峰博士撰寫；牛蛙實驗動物部份由廖有地博士撰寫 。
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The Zebrafish Information Network: http://www.zfin.org


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